高强度间歇游泳运动对有训练大鼠心肌的差异表(2)

1.5 高通量测序数据的预处理

在高通量测序原始数据的基础上，对其进行如下过滤处理：1）将低质量序列去掉；2）去除包含未知碱基的reads；3）去除没有3'接头序列的reads；4）剪切掉3'接头序列；5）去除短于18 nt 或长于30 nt 的序列。经过滤处理后，获得长度为18～30 nt 的高质量的clean reads。然后，再通过对Rfam 和GenBank 数据库进行相似性搜索，过滤掉可能是mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、srpRNA 和scRNA 等的序列。

1.6 已知miRNA 的鉴定

运用BLAST 程序，将过滤后剩余的sRNA 序列与miRBase 数据库搜索比对，凡是能与数据库中已储存动物物种的已知miRNA 匹配的sRNA 序列，就可以将其看作是一个已知miRNA。

1.7 预测新的候选miRNA

运用Soap 程序将剩余未注释的sRNA 序列与大鼠基因组序列进行比对，挑选出能与大鼠基因组序列完美匹配的sRNA 序列。然后，利用miRNA 预测软件MIREAP 从中预测出新的候选miRNA（novel miRNA）。

1.8 miRNA 差异表达分析

基于sRNA 高通量测序数据，计算出每个miRNA 的表达量。首先将两组大鼠各自miRNA 的表达量进行标准化处理，然后对这两组间的miRNA 进行差异表达分析。使用|log2（FC）|≥1 且错误发现率（FDR）≤0.01 作为差异表达的筛选标准（Jiang et al.,2018），其中，以差异倍数（Fold Change，FC）表示两组间表达量的比值，即HIST 组表达量与CK 组表达量之间的比值。若log2（FC）≥1，则表示miRNA表达上调；若log2（FC）≤-1，则表示miRNA 表达下调。

1.9 miRNA 靶基因预测及功能富集分析

针对差异表达miRNA，运用miRNA 靶基因预测软件miRanda、RNAhybrid 和TargetScan 从NCBI 数据库中大鼠基因对应的cDNA 序列中预测出miRNA 对应的靶基因。这里使用大鼠基因对应的cDNA 序列来自：（ e_info）。然后，对miRNA 靶基因进行功能注释，对其进行GO 与KEGG 分析，进而预测出miRNA 可能的调控功能。

2 结果与分析

2.1 建模情况

第1 周第1 天测得血乳酸安静值（6. mmol/L），血乳酸变化值随轮次增加逐渐递增且变化值均大于安静值，根据Voltarelli（2002）的理论，符合高强度间歇游泳运动的模型标准，模型建立成功。训练期间第1 周出现第8～10 轮次训练时部分大鼠不能坚持的情况（累计13 鼠·轮次），作减重至3%处理后完成训练，之后训练过程中所有大鼠均能坚持做完负重5%体重的间歇训练，建模达到预期效果。

2.2 miRNA 高通测序数据预处理与分析

经高通量测序，CK 组大鼠获得15 499 132 条测序原始数据（raw reads），HIST 组获得15 803 934 条raw reads。经过滤处理后，各自分别得到13 864 049（CK 组）和14 460 159（HIST 组）条过滤后得到的Reads 数据（clean reads）（表1）。其中，CK 组有8 901 163（64.2%）条reads 被定位（mapped）到大鼠基因组上，HIST 组有8 904 502（61.58%）条reads 被定位到大鼠基因组上。

表1 sRNA 高通测序数据的概括统计Table 1 Summary Statistics of Small RNA Deep Sequencing测序原始数据 过滤后得到的 reads 数据clean reads/n 非重复序列的 小RNA 数据/n 定位到大鼠基因组上的全部小RNA n % CK 组 15 499 132 13 864 049 436 194 8 901 163 64.2 HIST 组 15 803 934 14 460 159 521 200 8 904 502 61.58

对过滤处理后的clean reads 进行长度分布分析，发现90%以上reads 长度集中在20～24 nt 之间，其中长度为22 nt 的read 最多，约占到了总clean reads 的一半（图1）。由此可见，测序得到的sRNA 序列的长度分布趋势与动物中成熟miRNA 的长度分布是一致的。

图1 不同长度的cleans reads 分布图Figure 1.The Distribution of Cleans Reads with Different Length

图2 两组大鼠组间共有及特有sRNA 的种类、数量韦恩图Figure 2.Wayne Diagram of Common and Specific Reads of Uniq_sRNA and Total_sRNA between Groups

两组大鼠中共有和特有的sRNA 种类（uniq_sRNA）和数量（total_sRNA）（图2）。两组共有的uniq_sRNA 是15.48%，共有的total_sRNA 是97.02%，这说明，二者共有的sRNA 表达量很高。

在clean reads（sRNA）中，通过数据库搜索比对，去除非miRNA 的序列（如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，srpRNA，scRNA，repeat-associated elements 等）后，CK 组与HIST 组分别得到了13 135 777 条和13 429 514条未被注释的序列（表2）。

表2 两组大鼠文库中各种sRNA 的分布Table 2 Classification/Annotation of Small RNAs in Two Groups' LibrariesCK 组 HIST 组 n % n % rRNA 520 706 3.76 775 788 5.37 snRNA 12 0 11 0 snoRNA 29 930 0.22 30 507 0.21 tRNA 70 630 0.51 58 538 0.40 Repbase 106 994 0.77 165 801 1.15 Unannotated 13 135 777 94.75 13 429 514 92.87共计 13 864 049 100 14 460 159 100

文章来源：《心脏杂志》 网址: http://www.xzzzzzs.cn/qikandaodu/2021/0324/650.html