藏黄牛与宣汉黄牛心脏表达谱比较(2) - 心脏杂志杂志社投稿_期刊论文发表|版面费|电话|编辑部- 心脏杂志

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藏黄牛与宣汉黄牛心脏表达谱比较(2)

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摘要：

1.8 RT-qPCR验证

根据反转录试剂盒（TaKaRa公司）说明书，对总RNA进行反转录合成cDNA，标记后于-20℃保存。

随机选取8个miRNAs，用U6[19]（F: GCTTCGG CAGCACATATACTAAAAT；R: CGCTTCACGAATT TGCGTGTCAT）作为内参基因，每个样品设置 3个重复。根据这8个miRNAs的成熟序列设计反转录及荧光定量PCR引物，引物序列见表1。利用Prime ScriptTM RT反转录试剂盒和TB Green Premix Ex TaqTMⅡ定量试剂盒，对目标miRNA在藏黄牛和宣汉黄牛心脏组织中的表达水平进行验证。

反应体系10 μL：5 μL SYBR premix Dimer Eraser（2×），上下引物各0.4 μL，无菌去离子水3.2 μL，cDNA1.0 μL。

定量程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，39个循环。

采用2-ΔΔCT法计算目的基因表达量，结果以“平均值±标准误差（Mean±SEM）”表示。

2 结果

2.1 数据处理统计

本次试验构建的6个文库，共获得95 223 513条原始读值，经过一系列过滤后得到藏黄牛和宣汉黄牛的高质量读值的序列分别为17 463 446条和13 662 812条，干净读值的序列分别为16 552 296条和12 055 304条（表2）。

通过高通量测序分析得到藏黄牛和宣汉黄牛高质量核酸序列长度均主要分布在21nt，分别为37.5%和32.1%，具体见图1。

表1 荧光定量引物Table 1 Fluorescent quantitative primersmiRNAs miRNAs引物序列（5'-3'）Primer sequence（5'-3'） bta-miR-99a-5pRT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAGATCF: CTGGAGAACCCGTAGATCCGAT bta-miR-100RT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAGTTF: CTGGAGAACCCGTAGATCCGAA miR-99-xRT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAAGAF: CTGGAG AACCCGTAGATCCGAT bta-miR-1468RT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAGCAAAF: CTGGAGGTCGTATCCAGTGCAG bta-miR-1RT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACATCTF: CTGGAGTCGGATCCGTCTGAGC bta-miR-148aRT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAGTTF: CTGGAGTCAGTGCACTACAGAA miR-101-yRT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTCAGTTF: CTGGAGTACAGTACTGTGATAA bta-miR-499RT primer: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAACATCAF: CTGGAGTTAAGACTTGCAGTGA miRNA统一反向引物Unified reverse primerGTGCAGGGTCCGAGGT

表2 数据过滤及去端头情况统计Table 2 Data filtering and de-joining statistics读段类型Type of reads藏黄牛1数量Count藏黄牛2数量Count藏黄牛3数量Count平均值Average value宣汉黄牛1数量Count宣汉黄牛2数量Count宣汉黄牛3数量Count平均值Average value 总读值Total reads (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) 高质量读值Reads with high quality (97.6229%) (97.7933%) (97.9652%) (98.4725%) (98.3403%)(98.3561%) 3' 端缺失Reads with null 3'adapter (0.2475%) (0.2227%) (0.4363%) (0.3219%) (0.2161%) (0.2513%) 插入缺失读值Reads with insert (0.6018%) (0.5167%) (0.2440%)0 (0.7762%) (0.5344%) (0.6929%) 5'端污染的读值5'adapter contaminants7946 (0.0471%) (0.1065%)7948 (0.0375%) (0.1337%) (0.1494%) (0.2974%) 小于18nt的读值Reads shorter than 18nt (2.5920%) (4.1727%) (2.2689%)5 (5.8068%) (7.3446%) (10.5316%) 含有poly(A)的序列Reads with polyA139 (0.0008%)133 (0.0009%)316 (0.0015%) (0.0003%)35 (0.0003%)59(0.0004%)44 低频数读值(< 2)Reads with Low frequency (1.3550%) (1.8897%) (1.3822%)57 (2.6461%) (2.2124%) (3.4811%) 干净读值Clean reads (95.1558%) (93.0908%) (95.6295%) (90.3150%) (89.5427%) (84.7453%)

2.2 miRNA 表达分析

差异表达分析共筛选出219个差异表达miRNAs，其中48个显著上调，171个显著下调（图2)。表3为差异表达中表达量较高的10个miRNAs。

2.3 miRNA靶基因预测及靶基因富集分析

2.3.1 miRNA 靶基因预测由表4可知，藏黄牛靶基因预测数量为58 111个，宣汉黄牛为58 541个，对应的靶基因位点数量为2 584 253个和3 017 725个。

2.3.2 miRNA 靶基因富集分析对差异表达miRNA的靶基因进行GO功能注释结果表明：miRNA靶基因显著富集55条GO条目，其中生物过程22条，细胞组分20条，分子功能13条。由图3可知，在生物过程中，细胞过程和单一生物过程富集水平最高，且显著富集前三的是GO:00（细胞内信号转导）、GO:00（RNA生物合成过程）和GO:0006351（转录，DNA模板化）；在分子功能中，结合和催化活性富集水平最高，且富集显著前三的是GO: 0005488（结合）、GO:0005515（蛋白质结合）和GO:00（离子结合）；在细胞组分中，细胞和细胞部分富集水平最高，且富集显著前三的是GO: 0005623（细胞）、GO:00（细胞组分）和GO: 0005622（细胞内）。

文章来源：《心脏杂志》网址: http://www.xzzzzzs.cn/qikandaodu/2021/0415/776.html