心脏细胞衰老与Uvrag基因的缺失(2)

1.4.2 real time RT-PCR检测小鼠心脏组织衰老相关分泌表型相关因子mRNA表达变化 取小鼠心脏组织约30 mg，用Trizol提取组织总RNA。检测其完整性并测得浓度后用于反转录。每个样本取500 ng总RNA，经反转录合成cDNA后用real time RT-PCR方法分析相关基因表达。 Gapdh作为内参。每组至少3个样本，每个样本设3个重复。Real time RT-PCR引物序列见表1。

表1 ｜Real time RT-PCR检测基因表达引物序列Table 1 ｜Primer sequences for real-time quantitative PCR小鼠基因 引物序列 (5’-3’)Forward Reverse白细胞介素1β CTT CAG GCA GGC AGT ATC ACT CAT TCT AAT GGG AAC GTC ACA CAC CAG白细胞介素6 ATC CAG TTG CCT TCT TGG GAC TGA TAA GCC TCC GAC TTG TGA AGT GGT C-C基序趋化因子2 CTT CTG GGC CTG CTG TTC A CCA GCC TAC TCA TTG GGA TCA基质金属蛋白酶9 AAT CTC TTC TAG AGA CTG GGA AGG AG AGC TGA TTG ACT AAA GTA GCT GGA组织基质金属蛋白酶组织抑制因子1 AGG TGG TCT CGT TGA TTT CTG组织基质金属蛋白酶组织抑制因子2 CAG TAA GGC CTG TAG CTG TGC GGC CGT GTA GAT MAC TCG ATⅠ型胶原α1链 GTG CTC CTG GTA TTG CTG GTGGC TCC TCG TTT TCC TTC TTⅢ型胶原α1链 GGG TTT CCC TGG TCC TAA AGCCT GGT TTC CCA TTT TCT CC Gapdh AAG AAG GTG GTG AAG CAG TCA TAC CAG GAA ATG AGC AGG TGG TCT CGT TGA TTT CTG

1.4.3 组织学方法

(1)切片制备：①组织切片：小鼠经深度麻醉后，用预冷40 g/L多聚甲醛溶液进行全身灌注，取下心脏置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定过夜(4 ℃)，PBS清洗后于体积分数70%乙醇中浸泡过夜，次日经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后用石蜡包埋，用石蜡切片机制备厚度为5 μm的石蜡切片；②冰冻切片：小鼠经40 g/L多聚甲醛溶液全身灌注后，取下心脏置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定4 h，然后于30%的蔗糖溶液中浸泡过夜(4 ℃)。次日用冰冻组织包埋液包埋，最后用冰冻切片机制备厚度为8 μm的冰冻切片，置于-80 ℃保存备用。

(2)苏木精-伊红染色检测心肌组织变化：石蜡切片经二甲苯脱蜡和乙醇复水后用苏木精染色10 min，经清水冲洗后于0.5%盐酸溶液(用体积分数70%乙醇溶液配制)中浸泡10 s，之后再次清水冲洗并于0.1%氨水浸泡1 min，再次清水冲洗并经梯度乙醇脱水后用伊红染色原液染色30 s，最终经100%乙醇脱水和二甲苯透明后用中性树胶封固，用光学显微镜观察并拍照。

(3)天狼猩红染色检测心肌组织变化：石蜡切片经二甲苯脱腊和乙醇复水后用天狼猩红溶液避光染色1 h，之后于乙酸溶液中清洗并经梯度乙醇脱水和二甲苯中透明，最后用中性树脂胶封固，用光学显微镜观察并拍照。

(4)衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-?-gal)染色检测心脏细胞衰老情况[30]：取心脏冰冻切片并加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液室温固定15 min，之后用PBS洗涤组织3次，加入染色工作液(X-gal)于37 ℃染色过夜，次日用PBS洗涤并用70%甘油封固。染色结果通过光学显微镜观察并拍照。用Imagine J软件对细胞衰老进行定量统计分析，即：衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性区域(蓝色)与整个视野背景之比(排除非细胞区域)，并用软件GraphPad Prism 8分析和作图。

1.4.4 透射电镜观察小鼠心肌细胞超微结构的变化 透射电镜样品制备参考文献[31]的方法进行。简述如下：从心脏左心室切取1 mm× 1 mm×1 mm的块状立方体组织置于2.5%戊二醛/磷酸缓冲液中，于4 ℃过夜，用常规方法制备样品切片并于透射电镜下观察。

1.4.5 蛋白免疫印迹检测小鼠心脏组织p53蛋白表达量 取小鼠心脏组织，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液提取组织蛋白，经紫外分光光度计定量分析后加入2 X Loading buffer后用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，之后与一抗在4 ℃孵育过夜。用缓冲液(TBST)洗膜后与二抗室温孵育1 h，用TBST缓冲液洗膜后与显影液孵育显色。最后拍照并进行定量分析(GAPDH作为内参蛋白)。

1.5 主要观察指标 ①Uvrag基因缺失小鼠心肌组织变化；②Uvrag基因缺失小鼠心脏β-半乳糖苷酶阳性细胞；③Uvrag基因缺失小鼠心脏衰老相关分泌表型因子表达；④Uvrag基因缺失小鼠细胞衰老调控蛋白p53表达。

1.6 统计学分析 用GraphPad Prism 8软件做数据统计分析。平均数用表示。两组间平均值比较采用student -t检验，多组间平均值比较采用单因素方差分析。P＜ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1Uvrag基因缺失导致心肌细胞重塑 细胞衰老通常导致细胞增大，超微结构异常等细胞重塑现象。结果发现3月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏形态结构和野生型对照组无显著差异；但8月龄的Uvrag基因缺失小鼠单个心肌细胞横截面积显著增大(图1A，B)，心肌纤维化显著增加(图1C，D)，心肌组织间隙明显增大(图1C)，提示衰老心肌细胞增多。透射电镜显示Uvrag基因缺失小鼠心肌细胞线粒体形态异常、排列紊乱，肌浆网肿胀(图2)，这些超微结构变化符合细胞衰老特征。以上结果提示Uvrag基因缺失促进了心脏细胞衰老。

文章来源：《心脏杂志》 网址: http://www.xzzzzzs.cn/qikandaodu/2021/0128/327.html