心脏细胞衰老与Uvrag基因的缺失(6)

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0 引言 Introduction细胞衰老是细胞不可逆地退出细胞周期，但保持活跃代谢的一种生理状态[1]，其特点包括细胞形态改变、线粒体和溶酶体功能障碍及衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)因子如炎症因子和趋化因子表达升高[1-2]。细胞衰老的发生可由多种因素导致，目前普遍认为，内环境稳态失衡、线粒体损伤及活性氧升高是导致细胞衰老的重要因素[3-4]。在分子水平，细胞衰老的发生和维持主要受p53和p16/Rb信号通路调控，其中p53激活后促使p21等一系列蛋白的表达，最终诱导细胞出现衰老样生长停滞[5-6]；而p16通过激活Rb抑制细胞周期蛋白激酶，从而在G1期阻滞细胞周期，导致细胞衰老[7]。目前认为p53/p21信号通路在复制性细胞衰老中起关键作用，而p16/Rb信号通路在早衰中至关重要。但是根据细胞类型和所处环境的不同，细胞衰老发生时，这2种信号通路可以同时或单独激活[8]。细胞衰老在多种生理过程中如胚胎发育[9-10]、组织修复及机体器官衰老起重要作用[11-14]。此外，越来越多的证据表明衰老细胞随年龄增长在体内累积，是衰老相关疾病如心血管疾病、肿瘤和神经退行性疾病的重要机制[15-17]。大量研究发现，用药物或遗传学方法清除衰老细胞可以延长寿命、延缓器官衰老及缓解衰老相关疾病。如用化疗药物靶向衰老细胞可改善组织纤维化[18]；清除肥胖小鼠脂肪组织衰老细胞能够改善代谢功能障碍[19]；非瑟酮可以通过减少小鼠细胞衰老改善健康并延长寿命[20]；心脏细胞中Bmi1过表达能够抑制心脏细胞衰老从而改善扩张型心肌病及心力衰竭[21]。研究表明在不同条件下，自噬既可以促进细胞衰老[22-23]，也可以抗细胞衰老[23-24]。在正常生理状态下，自噬通过清除细胞受损线粒体及活性氧从而维持细胞内环境稳态。随着年龄的增长，细胞自噬功能下降，导致细胞受损线粒体累积，活性氧升高，进而促进细胞衰老发生[25-26]。紫外线抵抗相关基因(ultraviolet resistance-associated gene，UVRAG)是自噬相关基因，具有多种生物学功能[27-28]。前期工作发现Uvrag基因缺失小鼠发生年龄相关心肌病伴有心功能下降，与细胞自噬受到阻断、细胞凋亡和炎症增加有关[29]。但细胞衰老是否为Uvrag基因缺失小鼠心肌病的发病机制尚不清楚。文章主要研究Uvrag基因缺失对心脏细胞衰老的作用。1 材料和方法 Materials and 设计 分组对照的动物实验 时间与地点 2017年11月至2019年12月在上海交通大学生命科学技术学院Bio-X中心实验室完成实验和数据的分析工作 材料1.3.1 实验动物 课题所用的Uvrag基因缺失小鼠的相关信息已报道，详见文献[29]。所用实验小鼠均是遗传背景为FVB/NJ的3月龄和8月龄雄性小鼠，Uvrag基因缺失小鼠由复旦大学发育生物学与分子医学研究所提供。Uvrag基因缺失杂合子雄性小鼠与Uvrag基因缺失杂合子雌性小鼠交配获得Uvrag基因缺失纯合子小鼠、Uvrag基因缺失杂合子小鼠和野生型小鼠。从上述Uvrag基因缺失纯合子小鼠和野生型小鼠中各取14只雄性小鼠分两批分别饲养到3月龄和8月龄。在无特殊病原菌级饲养条件下, 光照和黑暗时间均为12 h(光照：07：00-19：00，黑暗：19：00-次日07：00)。饲养环境维持恒温、恒湿及恒压。课题中所有动物实验均符合国际研究委员会指导准则及上海市动物福利与保护委员会的相关要求 试剂 兔源性GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz公司)，兔源性p53多克隆抗体(Proteintech公司)，HRP标记的山羊抗兔IgG(麦约尔公司)，TRIzol总RNA提取试剂(生工生物工程公司)，苏木精-伊红染色液(南京建成生物工程研究所)，衰老相关-β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天公司)，cDNA 合成(反转录)试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) system(Roche公司)，Western blot显影试剂盒ImmobilonTMwestern Chemiluminescent HRP substrate (Millipore公司 )，Uvrag基因引物及RT-PCR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，蛋白酶K(Millipore公司)，Taq酶(碧云天公司) 实验方法1.4.1 实验小鼠基因型鉴定Uvrag基因缺失小鼠基因型鉴定按文献[29]进行。提取鼠尾DNA作为小鼠基因型鉴定的模板。以GL，PB及GR引物用常规PCR方法对鼠尾DNA进行扩增，然后将PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，通过观察PCR扩增条带大小判断相应小鼠Uvrag基因存在情况。GL，PB及GR引物序列如下：GL：5’-AAA AAT CAG AGG CCG GAG GAT TG-3’；PB：5’-CTG AGA TGT CCT AAA TGC ACA GCG-3’；GR：5’-TTT ACA GCA AGC AGC TTT CAA AAG G- real time RT-PCR检测小鼠心脏组织衰老相关分泌表型相关因子mRNA表达变化 取小鼠心脏组织约30 mg，用Trizol提取组织总RNA。检测其完整性并测得浓度后用于反转录。每个样本取500 ng总RNA，经反转录合成cDNA后用real time RT-PCR方法分析相关基因表达。 Gapdh作为内参。每组至少3个样本，每个样本设3个重复。Real time RT-PCR引物序列见表1。表1 ｜Real time RT-PCR检测基因表达引物序列Table 1 ｜Primer sequences for real-time quantitative PCR小鼠基因 引物序列 (5’-3’)Forward Reverse白细胞介素1β CTT CAG GCA GGC AGT ATC ACT CAT TCT AAT GGG AAC GTC ACA CAC CAG白细胞介素6 ATC CAG TTG CCT TCT TGG GAC TGA TAA GCC TCC GAC TTG TGA AGT GGT C-C基序趋化因子2 CTT CTG GGC CTG CTG TTC A CCA GCC TAC TCA TTG GGA TCA基质金属蛋白酶9 AAT CTC TTC TAG AGA CTG GGA AGG AG AGC TGA TTG ACT AAA GTA GCT GGA组织基质金属蛋白酶组织抑制因子1 AGG TGG TCT CGT TGA TTT CTG组织基质金属蛋白酶组织抑制因子2 CAG TAA GGC CTG TAG CTG TGC GGC CGT GTA GAT MAC TCG ATⅠ型胶原α1链 GTG CTC CTG GTA TTG CTG GTGGC TCC TCG TTT TCC TTC TTⅢ型胶原α1链 GGG TTT CCC TGG TCC TAA AGCCT GGT TTC CCA TTT TCT CC Gapdh AAG AAG GTG GTG AAG CAG TCA TAC CAG GAA ATG AGC AGG TGG TCT CGT TGA TTT CTG1.4.3 组织学方法(1)切片制备：①组织切片：小鼠经深度麻醉后，用预冷40 g/L多聚甲醛溶液进行全身灌注，取下心脏置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定过夜(4 ℃)，PBS清洗后于体积分数70%乙醇中浸泡过夜，次日经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后用石蜡包埋，用石蜡切片机制备厚度为5 μm的石蜡切片；②冰冻切片：小鼠经40 g/L多聚甲醛溶液全身灌注后，取下心脏置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定4 h，然后于30%的蔗糖溶液中浸泡过夜(4 ℃)。次日用冰冻组织包埋液包埋，最后用冰冻切片机制备厚度为8 μm的冰冻切片，置于-80 ℃保存备用。(2)苏木精-伊红染色检测心肌组织变化：石蜡切片经二甲苯脱蜡和乙醇复水后用苏木精染色10 min，经清水冲洗后于0.5%盐酸溶液(用体积分数70%乙醇溶液配制)中浸泡10 s，之后再次清水冲洗并于0.1%氨水浸泡1 min，再次清水冲洗并经梯度乙醇脱水后用伊红染色原液染色30 s，最终经100%乙醇脱水和二甲苯透明后用中性树胶封固，用光学显微镜观察并拍照。(3)天狼猩红染色检测心肌组织变化：石蜡切片经二甲苯脱腊和乙醇复水后用天狼猩红溶液避光染色1 h，之后于乙酸溶液中清洗并经梯度乙醇脱水和二甲苯中透明，最后用中性树脂胶封固，用光学显微镜观察并拍照。(4)衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-?-gal)染色检测心脏细胞衰老情况[30]：取心脏冰冻切片并加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液室温固定15 min，之后用PBS洗涤组织3次，加入染色工作液(X-gal)于37 ℃染色过夜，次日用PBS洗涤并用70%甘油封固。染色结果通过光学显微镜观察并拍照。用Imagine J软件对细胞衰老进行定量统计分析，即：衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性区域(蓝色)与整个视野背景之比(排除非细胞区域)，并用软件GraphPad Prism 8分析和作?透射电镜观察小鼠心肌细胞超微结构的变化 透射电镜样品制备参考文献[31]的方法进行。简述如下：从心脏左心室切取1 mm× 1 mm×1 mm的块状立方体组织置于2.5%戊二醛/磷酸缓冲液中，于4 ℃过夜，用常规方法制备样品切片并于透射电镜下观察 蛋白免疫印迹检测小鼠心脏组织p53蛋白表达量 取小鼠心脏组织，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液提取组织蛋白，经紫外分光光度计定量分析后加入2 X Loading buffer后用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，之后与一抗在4 ℃孵育过夜。用缓冲液(TBST)洗膜后与二抗室温孵育1 h，用TBST缓冲液洗膜后与显影液孵育显色。最后拍照并进行定量分析(GAPDH作为内参蛋白) 主要观察指标 ①Uvrag基因缺失小鼠心肌组织变化；②Uvrag基因缺失小鼠心脏β-半乳糖苷酶阳性细胞；③Uvrag基因缺失小鼠心脏衰老相关分泌表型因子表达；④Uvrag基因缺失小鼠细胞衰老调控蛋白p53表达 统计学分析 用GraphPad Prism 8软件做数据统计分析。平均数用表示。两组间平均值比较采用student -t检验，多组间平均值比较采用单因素方差分析。P＜ 0.05为差异有显著性意义。2 结果 基因缺失导致心肌细胞重塑 细胞衰老通常导致细胞增大，超微结构异常等细胞重塑现象。结果发现3月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏形态结构和野生型对照组无显著差异；但8月龄的Uvrag基因缺失小鼠单个心肌细胞横截面积显著增大(图1A，B)，心肌纤维化显著增加(图1C，D)，心肌组织间隙明显增大(图1C)，提示衰老心肌细胞增多。透射电镜显示Uvrag基因缺失小鼠心肌细胞线粒体形态异常、排列紊乱，肌浆网肿胀(图2)，这些超微结构变化符合细胞衰老特征。以上结果提示Uvrag基因缺失促进了心脏细胞衰老。图 1｜Uvrag基因缺失导致心肌细胞重塑Figure 1 ｜Uvragdeficiency results in cardiomyocyte remodeling图注：图A为3月龄和8月龄Uvrag基因缺失小鼠和野生型对照小鼠心脏组织切片(苏木精-伊红染色，标尺=40 μm)；B为8月龄Uvrag基因缺失小鼠和野生型小鼠心肌细胞横截面积定量(P=0.034 1)；C为3月龄和8月龄Uvrag基因缺失小鼠和野生型对照小鼠心脏组织切片(天狼猩红染色，标尺=40 μm)；D为8月龄Uvrag基因缺失小鼠和野生型小鼠心肌组织纤维化定量(P=0.001 4)。+/+表示野生型小鼠(n=4)，-/-表示Uvrag基因缺失小鼠(n=4)。student -t检验，aP＜0.05图 2｜Uvrag基因缺失小鼠心肌细胞超微结构的变化Figure 2 ｜Ultrastructural changes of cardiomyocytes inUvrag-deficient mice图注：图A，B为野生型小鼠心肌细胞图片(A标尺=10 μm，B 标 尺 =5 μm)；C，D为Uvrag基因缺失小鼠心肌细胞图片(C标尺=10 μm，D 标尺 =5 μm)。可见Uvrag基因缺失小鼠心肌细胞线粒体形态异常、排列紊乱，内质网肿胀2.2Uvrag基因缺失导致心脏β-半乳糖苷酶阳性细胞显著增多 结果显示3月龄和8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏组织衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞较相应野生型对照组显著增多，并且对比3月龄Uvrag基因缺失小鼠，8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞进一步增多，而两组野生型对照组间无显著差异(图3)。这些结果提示Uvrag基因缺失促进心脏细胞衰老基因缺失促进心脏衰老相关分泌表型因子表达衰老细胞可以分泌衰老相关分泌表型因子如炎症及趋化因子等，因此衰老通常伴有慢性炎症。目前认为衰老相关分泌表型是细胞衰老的标记物[2]。结果显示3月龄和8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏白细胞介素1β、白细胞介素6和C-C基序趋化因子2表达量较相应野生型对照组均显著上调(图4A-C，I-K)。此外，3月龄和8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏组织基质金属蛋白酶组织抑制因子1 mRNA表达量较相应野生型对照组显著上调，而基质金属蛋白酶9及基质金属蛋白酶组织抑制因子2的mRNA表达量无显著变化(图4F-H，N-P)。有趣的是3月龄Uvrag基因缺失小鼠Ⅰ型胶原α1链及Ⅲ型胶原α1链表达显著上调(图4D，E)，而8月龄Uvrag基因缺失小鼠Ⅰ型胶原α1链及Ⅲ型胶原α1链水平和野生型对照小鼠相似(图4L，M)。总体上这些结果表明Uvrag基因缺失导致心脏衰老相关分泌表型因子表达增多基因缺失对细胞衰老调控蛋白p53表达量影响结果显示3月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏p53蛋白表达量无显著变化(图5A，B)，而8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏p53蛋白含量显著上调(图5C，D)。这些证据进一步支持Uvrag基因缺失导致心脏细胞衰老。图 3｜Uvrag基因缺失小鼠心脏衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞增多Figure 3 ｜ Senescence-associated ?-galactosidase-positive cells are increased in the heart ofUvrag-deficient mice图注：图A为 3月龄和8月龄Uvrag基因缺失小鼠和野生型对照小鼠心脏细胞(衰老相关-β半乳糖苷酶染色，箭头指染色阳性细胞，标尺=40 μm)；B为3月龄小鼠衰老相关-β半乳糖苷酶染色阳性细胞定量(P＜ 0.000 01)；C为8月龄小鼠衰老相关-β半乳糖苷酶染色阳性细胞定量(P＜ 0.000 01)。+/+表示野生型小鼠(n=4)，-/-表示Uvrag基因缺失小鼠(n=4)。单因素方差分析，aP＜ 0.053 讨论 Discussion目前大量的证据表明细胞衰老是心脏衰老及衰老相关心脏疾病的重要机制。前期工作发现Uvrag通过调控心脏细胞自噬体成熟介导心脏细胞自噬，其缺失会导致心脏细胞的自噬功能因自噬流的阻断而受损，在此过程中小鼠会表现出年龄相关心的肌病并伴有心功能下降[29]，但细胞衰老在其中的作用尚不清楚。前期工作发现青年Uvrag基因缺失小鼠(2月龄及6月龄)心脏形态结构正常，而中年Uvrag基因缺失小鼠(10月龄)发生扩张型心肌病。为了研究细胞衰老是否为Uvrag基因缺失小鼠扩张型心肌病的机制，此次选取青年(3月龄)和中年Uvrag基因缺失小鼠(8月龄)作为研究对象；年龄及性别相匹配的野生型小鼠作为对照。图 4｜Uvrag基因缺失对小鼠心脏衰老相关分泌表型因子mRNA表达影响Figure 4｜The effect ofUvragdeficiency on senescence-associated secretory phenotype mRNA expression in the mouse heart图注：3月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏组织白细胞介素1β (A)(P=0.025 7)、白细胞介素6(B)(P=0.000 5)、C-C基序趋化因子2(C)(P=0.011 9)、Ⅰ型胶原α1链(D)(P=0.004 8)、Ⅲ型胶原α1链(E)(P=0.025 6)及组织基质金属蛋白酶组织抑制因子(Timp)1(G)(P=0.0149)表达显著上调，基质金属蛋白酶9(F)和Timp2(H)表达较野生型对照组无显著差异；8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏组织白细胞介素1β(I)(P=0.037 3)，白细胞介素6(J)(P=0.004 2)，C-C基序趋化因子2(K)(P=0.034 2)，及Timp1(O)(P=0.044 9)表达显著上调，Ⅰ型胶原α1链(L)，Ⅲ型胶原α1链(M)，基质金属蛋白酶9(N)及Timp2(P)表达较野生型对照组无显著差异。+/+表示野生型小鼠(n=3)，-/-表示Uvrag基因缺失小鼠(n=3)。student -t检验，aP＜ 0.05图 5｜Uvrag基因缺失对心脏组织p53蛋白表达的影响Figure 5｜Effect ofUvragdeficiency on p53 expression in the mouse heart图注：图A，B分为3月龄小鼠p53蛋白免疫印迹图和定量比较；C，D分为8月龄小鼠p53蛋白免疫印迹图和定量比较(P=0.002 9)。+/+表示野生型小鼠(n=3)，-/-表示Uvrag基因缺失小鼠(n=3)。student -t检验，aP＜ 0.05此次研究发现Uvrag基因缺失促进心脏细胞衰老，可能是Uvrag基因缺失导致心肌病的重要机制。支持证据如下：①Uvrag基因缺失小鼠心肌细胞横截面积增大，线粒体形态异常、排列紊乱，内质网肿胀，这些符合细胞衰老的特征。②Uvrag基因缺失小鼠心脏衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞显著增多。此外，衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞增多出现在心脏重构之前，提示细胞衰老可能是Uvrag基因缺失导致的心肌病致病机制。③衰老相关分泌表型基因表达上调是鉴定细胞衰老的另一标志物。此次研究发现Uvrag基因缺失小鼠心脏白细胞介素1β、 白细胞介素6及Ccl2等基因表达显著升高。④p53和p16信号通路在细胞衰老的发生和维持中至关重要。Uvrag基因缺失小鼠心脏p53蛋白表达显著上调，尽管p16表达无显著变化(数据未显示)。这些证据有力证实了Uvrag基因缺失促进心脏细胞衰老。课题组之前的研究结果表明Uvrag基因缺失小鼠心脏炎症细胞浸润增加，炎症因子表达上调。鉴于衰老细胞能够分泌衰老相关分泌表型因子如炎症因子和趋化因子[2]，因此Uvrag基因缺失小鼠心脏炎症增加至少部分是由于心脏细胞衰老导致。Uvrag基因缺失小鼠心脏各种类型细胞衰老情况及其对心脏炎症的作用需要进一步研究。此外课题组的前期工作发现Uvrag基因缺失小鼠心脏细胞凋亡增加，与心脏细胞自噬阻断相关。Uvrag基因缺失小鼠心脏细胞凋亡与细胞衰老是否有关尚不清楚。目前已知衰老细胞通常启动抗凋亡信号通路拮抗凋亡发生[32]。但Uvrag基因缺失可能会解除衰老细胞的抗凋亡信号通路，这有待进一步研究。当然，Uvrag基因缺失小鼠心脏细胞凋亡和细胞衰老也可能是相互独立的，发生在不同细胞。自噬在细胞衰老发生中起重要作用。目前认为在不同条件下，自噬对细胞衰老起不同作用，如在癌基因过表达的情况下，自噬促进细胞衰老发生[22]；而在正常生理条件下，自噬维持细胞稳态，抑制细胞衰老发生。自噬阻断导致线粒体功能异常，氧化压力升高，从而诱导细胞衰老[24-25，33]。基于Uvrag基因缺失小鼠心脏自噬受到抑制，并且异常线粒体增加，因此在生理条件下，Uvrag介导的自噬抑制细胞衰老发生，这可能在维持正常心脏结构和功能中起重要作用。鉴于Uvrag基因缺失小鼠细胞衰老增加(包括除心脏外的其他器官，如脑和肾脏，数据未显示)，而细胞衰老是器官和机体衰老的主要机制，因此Uvrag可能是延缓器官和机体衰老的分子靶点。已有动物研究显示，Uvrag拮抗互作蛋白Rubicon基因缺失能够延缓动物器官衰老，延长动物寿命[34]。Uvrag活性上调是否可以促进自噬，抑制细胞衰老，进而延缓器官衰老，延长寿命？Rubicon缺失是否通过增强Uvrag活性从而促进自噬，抑制细胞衰老，延长寿命？这都是将来需要回答的问题。肿瘤抑制基因p53是调控细胞衰老的关键因子。作者发现3月龄和8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏衰老细胞均增多，但p53蛋白表达仅在8月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏显著上调，而在3月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏无显著变化。这可能是由于在3月龄Uvrag基因缺失小鼠心脏p53活性发生了变化，尽管蛋白水平未升高；另一种可能是由于早期p53蛋白丰度升高，但差异超出了作者能够检测的范围。p53升高不仅能够诱导心脏细胞衰老，而且在心脏细胞衰老维持中也可能起着重要作用，其机制可能为：细胞浆p53与parkin结合阻止后者向线粒体膜表面转位，从而抑制线粒体自噬[35]，进而导致损伤线粒体累积，活性氧升高。总之，此次研究发现Uvrag基因缺失促进小鼠心脏细胞衰老。Uvrag基因是潜在的延缓心脏衰老及抗衰老相关心脏疾病的靶分子。作者贡献：研究设计为通讯作者，实施为全体作者，第一作者成文，通讯作者审校。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金()”“上海市自然科学基金(16ZR)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。机构伦理问题：实验方案经上海交通大学动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 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