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Cx43敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心(2)
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摘要：1.4 实验方法 1.4.1 石蜡切片制备 10-13 d小鼠胚胎用Leica切片机(RM2235，德国)制作7 μm 厚连续切片，连续切片每隔5片取1片做苏木精-伊红染色，观察形态学特征
1.4 实验方法
1.4.1 石蜡切片制备 10-13 d小鼠胚胎用Leica切片机(RM2235，德国)制作7 μm 厚连续切片，连续切片每隔5片取1片做苏木精-伊红染色，观察形态学特征，其他用于免疫组织化学染色和荧光双染检测。
1.4.2 免疫组织化学染色 选用SABC法染色[20]。切片脱蜡、水化后用体积分数3%过氧化氢和5%BSA封闭液(武汉博士德生物工程有限公司)各处理30 min，降低内源性过氧化物酶活性和非特异性背景颜色。预处理后切片用抗Isl1抗体(1∶700，Abclonal公司)，抗Ap2α单克隆抗体(1∶100，Genetex公 司)，抗Cx43抗 体(1∶700，Abcam公 司)，抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(1∶1 000，武汉博士德生物工程有限公司)，抗心肌肌球蛋白重链单克隆抗体(MHC，1∶1 000，upstate公司)，4 ℃过夜孵育。即用型SABC-POD小鼠/兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG，SABC试剂各常温下孵育30 min。DAB显色，常规脱水、透明及封固。全自动扫描显微镜及照相系统(BX53，日本奥林帕斯公司)下摄片，观察各细胞分布规律并对Isl1标记第二生心区细胞或Ap2α标记的心脏神经嵴细胞计数，每个胚龄胚胎选取3例，每例胚胎选取动脉端区域免疫组织化学染色后的切片，每3片选出1片，共选3片，于200倍镜下拍摄，再用Image J软件分别对每张图片中的Isl1阳性或Ap2α阳性细胞计数(胞核着棕黄色为阳性)；每列胚胎的3片计数结果取均值作为该胚胎的阳性细胞数。
1.4.3 免疫荧光双染检测 切片脱蜡、水化，体积分数5%BSA封闭，特异标记兔抗Isl1抗体(1∶100，Abclonal公司)和鼠抗Cx43单克隆抗体 (1∶200，Santa cruz公司)混合，兔抗Ap2α单克隆抗体(1∶50，Cell Signal公司)和鼠抗Cx43单克隆抗体 (1∶200，Santa Cruz公司)混合，4 ℃孵育过夜后，双染二抗均为羊抗小鼠IgG-FITC(1∶150，武汉博士德生物工程有限公司)和羊抗兔IgG-Cy3(1∶100，武汉博士德生物工程有限公司) 混合液，电热恒温箱(ZXDP-B2120，上海智诚公司)37 ℃孵育30 min，4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI，碧云天生物技术研究所)室温下核复染10 min，甘油缓冲液封固，全自动扫描显微镜及照相系统照像，Image J软件将同一位置所摄两张双染抗体图片以及DIC图片进行合成[20]，镜下观察细胞分布规律。
1.4.4 三维重建 选择胚龄13 d 的Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎免疫组织化学染色和苏木精-伊红染色后的连续切片图，收集所有图片后上传Amira 5.2.0软件处理生成三维立体结构后观察主肺动脉位置变化[21]。
1.5 主要观察指标 胚龄10-13 d的转基因Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎心脏切片免疫组织化学染色形态。
1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，数据用±s表示，多组间数据差异比较单因素方差分析，P＜0.05为差异显著性意义。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 实验选取胚龄10-13 d的 Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎共40只，Cx43+/+小鼠作为对照组共25只，舍去5只未达标准胚胎，其他胚龄10，11，11.5，13 d小鼠各5只全部纳入实验结果进行分析；Cx43-/-小鼠作为实验组共15只，胚龄10，11，13 d各5只。在整个实验过程中小鼠无脱失，全部纳入实验结果进行分析。
2.2 Cx43基因敲除小鼠Isl1阳性细胞的迁移和分布变化 小鼠胚龄10 d，心管向右弯曲成襻，可分辨心室、心房和流出道。流出道壁由心肌、内皮及二者之间的心胶质构成。流出道远端与动脉囊相连，动脉囊背侧与前肠腹侧内胚层相邻，两侧与弓动脉相通。Cx43+/+小鼠胚胎前肠腹侧壁内胚层的正中部与两侧相比，表达较强的Isl1，且内胚层正中部的腹侧出现密集的间充质细胞，同样为Isl1强阳性，见图1A，B，连续切片观察这些Isl1阳性间充质细胞经弓动脉之间延伸至心包腔背侧壁，在前肠腹侧正中形成Isl1阳性细胞带，见图1C。鳃弓核心间充质Isl1阳性细胞聚集，并与心包腔背侧壁、流出道远端壁形成两侧的Isl1阳性细胞带，见图1A。相邻切片染色显示流出道远端壁的Isl1阳性区表达较强的α-SMA和较弱的MHC，见图1D，E，提示Isl1阳性细胞正在向心肌细胞分化。前肠腹侧、心包腔背侧壁及流出道远端壁部分Isl1阳性细胞同时表达Cx43，见图1F。
Cx43-/-小鼠未见Cx43表达，进一步确认基因敲除成功，见图2A。与野生型小鼠相比，Cx43基因敲除小鼠胚龄10 d，前肠腹侧内胚层的正中部仍表达Isl1，相邻间充质内也可见Isl1阳性细胞密集分布，见图2B，C；但鳃弓核心间充质的Isl1阳性表达少于野生型小鼠胚胎，见图1A，2D。相邻切片染色显示流出道远端仍表达较强的α-SMA和较弱的MHC，见图2E，F，说明Isl1阳性细胞仍可向心肌细胞分化。
文章来源：《心脏杂志》 网址: http://www.xzzzzzs.cn/qikandaodu/2021/0128/328.html