Cx43敲除小鼠胚胎心脏流出道内第二生心区和心(7)

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BACKGROUND:Cx43 plays an important role in human congenital heart disease. However, there is still no consistent conclusion about the formation mechanism of cardiac malformation in Cx43 knockout mouse embryos.

OBJECTIVE:To investigate the cardiac development defects and the migration and differentiation of progenitor cells of the second heart field and cardiac neural crest in Cx43 knockout mouse :Serial sections of Cx43 gene knockout homozygous (Cx43-/-) mouse and Cx43 wild-type (Cx43+/+) mouse embryos from embryonic day (ED) 10 to ED13 were made for immunohistochemical and immunofluorescent staining, and three-dimensional reconstruction of the AND CONCLUSION:(1) In Cx43 gene knockout mouse embryos at ED10-ED11, Isl1 positive second heart field cells in the ventral mesenchyme of the foregut extended through the area between the bilateral arch arteries to the dorsal wall of pericardial cavity. Meanwhile, Isl1 positive cells in the core mesenchyme of the branchial arches were continuous with those in the dorsal wall of pericardial cavity and the distal wall of the outflow tract. At ED13, the distribution of Isl1 positive cells was observed in the wall of the ascending aorta and pulmonary trunk as well as the wall of the left and right outflow tracts of the septated ventricles. However, compared with wild-type mouse embryos, fewer Isl1 positive second heart field cells were found in Cx43 gene knockout mouse embryos (P＜ 0.01). (2) During ED10 to ED11, Ap2α positive neural crest cells were still found in the wall of the arch artery and the dorsal and ventral walls of the aortic sac in Cx43 gene knockout mouse embryos, but the number of neural crest cells was less than that of wild-type mouse embryos (P＜ 0.01).(3) These results indicate that the migration path and distribution pattern of Isl1 positive second heart field cells and Ap2α positive cardiac neural crest cells are similar between the Cx43 gene knockout and wild-type mouse embryos, but the number of two kinds of migrating cells is reduced after Cx43 gene suggests that in addition to cardiac neural crest derived cells, the decrease of second heart field progenitor cells might be involved in the formation of outflow tract malformations in Cx43 knockout mouse embryos.

0 引言 Introduction缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)广泛表达于心房和心室工作心肌、心室传导系统和心脏神经嵴细胞[1-5]，在心电传导、流出道正常发育和调节心脏神经嵴细胞的迁移行为中起着重要作用。Cx43基因敲除小鼠表现为心脏成襻延迟[3]、流出道梗阻及主动脉弓离断等[3，6]。已有研究证实敲除Cx43基因后p38 MAPK活性下调，FGF1表达增加，促进心肌细胞增生[7]，从而导致流出道梗阻。但有学者认为Cx43基因敲除小鼠死于右心室流出道梗阻也可由于心脏神经嵴细胞迁移异常所导致[6]。但特异性敲除神经嵴的Cx43基因，胚胎心脏并未发生形态异常[8]。因此，Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道畸形的发生机制有待进一步研究。心脏神经嵴即耳板中部到第3体节水平的神经嵴，在参与心脏发育的过程中，需要Cx43缝隙连接的作用[9-10]。如上所述，特异性敲除神经嵴的Cx43基因，胚胎心脏并未发生形态异常，此结果提示可能是敲除Cx43后，其他因素影响了心脏神经嵴细胞的迁移从而导致流出道畸形的发生。另有研究揭示Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏流出道畸形是由于流出道心肌分化异常所导致[11]。大量研究表明，流出道心肌来源于第二生心区，第二生心区的异常发育可引发流出道心肌分化异常[12-14]；另一方面，第二生心区可通过多种信号通路调节心脏神经嵴[15-19]，例如抑制第二生心区中Notch信号，可导致心脏神经嵴细胞向流出道迁移发生异常[15]。由此实验推测，第二生心区的异常发育可能是Cx43基因敲除小鼠胚胎发生心脏流出道畸形的一个原因。但目前，Cx43基因敲除小鼠胚胎第二生心区是否异常尚未见报道。实验用免疫组织化学染色、荧光双染及三维重建的方法观察Cx43基因敲除后流出道的畸形与Isl1阳性第二生心区前体细胞和Ap2α阳性神经嵴细胞的迁移路径、分布模式，以确认Cx43基因敲除小鼠胚胎第二生心区发育是否异常，为进一步探讨Cx43基因敲除导致流出道发育异常的发生机制提供形态学依据。1 材料和方法 Materials and 设计 细胞学体外实验 时间及地点 于2018年4月至2019年12月在山西医科大学组织胚胎学实验室完成 材料 Cx43转基因C57BL6小鼠共20只，体质量28-35 g。收集胚龄10-13 d Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎40只，每个胚龄胚胎收集5只，所使用小鼠均来自山西医科大学，动物许可证号：SCXK(晋)2015-0001。所有动物操作均符合山西医科大学伦理委员会对动物实验的要求和规定 实验方法1.4.1 石蜡切片制备 10-13 d小鼠胚胎用Leica切片机(RM2235，德国)制作7 μm 厚连续切片，连续切片每隔5片取1片做苏木精-伊红染色，观察形态学特征，其他用于免疫组织化学染色和荧光双染检测 免疫组织化学染色 选用SABC法染色[20]。切片脱蜡、水化后用体积分数3%过氧化氢和5%BSA封闭液(武汉博士德生物工程有限公司)各处理30 min，降低内源性过氧化物酶活性和非特异性背景颜色。预处理后切片用抗Isl1抗体(1∶700，Abclonal公司)，抗Ap2α单克隆抗体(1∶100，Genetex公 司)，抗Cx43抗 体(1∶700，Abcam公 司)，抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(1∶1 000，武汉博士德生物工程有限公司)，抗心肌肌球蛋白重链单克隆抗体(MHC，1∶1 000，upstate公司)，4 ℃过夜孵育。即用型SABC-POD小鼠/兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG，SABC试剂各常温下孵育30 min。DAB显色，常规脱水、透明及封固。全自动扫描显微镜及照相系统(BX53，日本奥林帕斯公司)下摄片，观察各细胞分布规律并对Isl1标记第二生心区细胞或Ap2α标记的心脏神经嵴细胞计数，每个胚龄胚胎选取3例，每例胚胎选取动脉端区域免疫组织化学染色后的切片，每3片选出1片，共选3片，于200倍镜下拍摄，再用Image J软件分别对每张图片中的Isl1阳性或Ap2α阳性细胞计数(胞核着棕黄色为阳性)；每列胚胎的3片计数结果取均值作为该胚胎的阳性细胞数 免疫荧光双染检测 切片脱蜡、水化，体积分数5%BSA封闭，特异标记兔抗Isl1抗体(1∶100，Abclonal公司)和鼠抗Cx43单克隆抗体 (1∶200，Santa cruz公司)混合，兔抗Ap2α单克隆抗体(1∶50，Cell Signal公司)和鼠抗Cx43单克隆抗体 (1∶200，Santa Cruz公司)混合，4 ℃孵育过夜后，双染二抗均为羊抗小鼠IgG-FITC(1∶150，武汉博士德生物工程有限公司)和羊抗兔IgG-Cy3(1∶100，武汉博士德生物工程有限公司) 混合液，电热恒温箱(ZXDP-B2120，上海智诚公司)37 ℃孵育30 min，4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI，碧云天生物技术研究所)室温下核复染10 min，甘油缓冲液封固，全自动扫描显微镜及照相系统照像，Image J软件将同一位置所摄两张双染抗体图片以及DIC图片进行合成[20]，镜下观察细胞分布规律 三维重建 选择胚龄13 d 的Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎免疫组织化学染色和苏木精-伊红染色后的连续切片图，收集所有图片后上传Amira 5.2.0软件处理生成三维立体结构后观察主肺动脉位置变化[21] 主要观察指标 胚龄10-13 d的转基因Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎心脏切片免疫组织化学染色形?统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，数据用±s表示，多组间数据差异比较单因素方差分析，P＜0.05为差异显著性意义。2 结果 实验动物数量分析 实验选取胚龄10-13 d的 Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎共40只，Cx43+/+小鼠作为对照组共25只，舍去5只未达标准胚胎，其他胚龄10，11，11.5，13 d小鼠各5只全部纳入实验结果进行分析；Cx43-/-小鼠作为实验组共15只，胚龄10，11，13 d各5只。在整个实验过程中小鼠无脱失，全部纳入实验结果进行分析 Cx43基因敲除小鼠Isl1阳性细胞的迁移和分布变化 小鼠胚龄10 d，心管向右弯曲成襻，可分辨心室、心房和流出道。流出道壁由心肌、内皮及二者之间的心胶质构成。流出道远端与动脉囊相连，动脉囊背侧与前肠腹侧内胚层相邻，两侧与弓动脉相通。Cx43+/+小鼠胚胎前肠腹侧壁内胚层的正中部与两侧相比，表达较强的Isl1，且内胚层正中部的腹侧出现密集的间充质细胞，同样为Isl1强阳性，见图1A，B，连续切片观察这些Isl1阳性间充质细胞经弓动脉之间延伸至心包腔背侧壁，在前肠腹侧正中形成Isl1阳性细胞带，见图1C。鳃弓核心间充质Isl1阳性细胞聚集，并与心包腔背侧壁、流出道远端壁形成两侧的Isl1阳性细胞带，见图1A。相邻切片染色显示流出道远端壁的Isl1阳性区表达较强的α-SMA和较弱的MHC，见图1D，E，提示Isl1阳性细胞正在向心肌细胞分化。前肠腹侧、心包腔背侧壁及流出道远端壁部分Isl1阳性细胞同时表达Cx43，见图1F。Cx43-/-小鼠未见Cx43表达，进一步确认基因敲除成功，见图2A。与野生型小鼠相比，Cx43基因敲除小鼠胚龄10 d，前肠腹侧内胚层的正中部仍表达Isl1，相邻间充质内也可见Isl1阳性细胞密集分布，见图2B，C；但鳃弓核心间充质的Isl1阳性表达少于野生型小鼠胚胎，见图1A，2D。相邻切片染色显示流出道远端仍表达较强的α-SMA和较弱的MHC，见图2E，F，说明Isl1阳性细胞仍可向心肌细胞分化。小鼠胚龄11 d，前肠内胚层腹侧Isl1阳性间充质细胞显著增多，形成锥形结构，经两侧弓动脉之间延伸至流出道远端壁，见图3A，该部位为α-SMA和MHC阳性，见图3B，C，即心肌性流出道远端直接与心包腔背侧壁相连续，鳃弓核心间充质的Isl1阳性细胞明显减少，且失去了与心包腔背侧壁的连续性(数据未显示)，即与胚龄10 d不同，至胚龄11 d，第二生心区Isl1阳性细胞主要分布于前肠腹侧间充质与心包腔背侧壁。免疫荧光双染结果显示前肠腹侧Isl1和Cx43双阳性间充质细胞较胚龄10 d增多，见图3D。Cx43-/-小鼠胚胎11 d，前肠腹侧内胚层正中部仍表达Isl1，由动脉端向静脉端移行，前肠内胚层腹侧的间充质、心包腔背侧壁，见图4A，均可见Isl1阳性细胞，但数量明显少于野生型小鼠胚胎，未能形成典型的锥形结构，见图3A，4A。相邻切片染色显示Isl1阳性的流出道远端可见α-SMA，MHC的表达，见图4B，C，提示流出道远端依然有心肌细胞分化，促使流出道继续增长。至胚龄11.5 d，前肠腹侧Isl1阳性的锥形结构体积增大，见图5A，B。动脉囊进入心包腔，MHC染色阴性，见图5C，因此成为流出道的非心肌部。锥形结构的尖端Isl1阳性细胞向流出道非心肌部延伸，见图5B，该部位α-SMA阳性，见图5D，MHC阴性说明此处迁入的Isl1阳性细胞不再向心肌细胞分化。胚龄13 d，心脏各部正在分隔，见图6A。流出道缩短，在Cx43+/+和Cx43-/-小鼠胚胎均可观察到流出道的非心肌部已分隔为升主动脉和肺动脉干。瓣膜以下的流出道心内膜垫正在融合形成流出道隔，将流出道分隔为左右两部分，即主动脉前庭和肺动脉圆锥。野生型小鼠胚胎升主动脉由肺动脉干右侧经腹侧斜上走行到达其左侧，形成成体心脏升主动脉、肺动脉干正常的解剖位置关系，见图6B-F。两动脉壁均分布有大量Isl1阳性细胞，与气管腹侧Isl1阳性细胞带相延续，见图6G，相邻切片显示α-SMA的强阳性表达，见图6F。瓣膜以下的心室流出道壁也可见Isl1阳性细胞分布，见图6G。而在Cx43-/-小鼠胚胎，连续切片与三维重建显示升主动脉由肺动脉干右侧首先直行离开心包腔，再横向左行形成主动脉弓，见图7A-F，而升主动脉在其直角转折处与肺动脉干直接相通，见图7B，升主动脉与肺动脉干管壁内Isl1阳性细胞数量明显少于野生型小鼠，气管腹侧间充质观察不到Isl1的表达，见图6G，7G，两动脉管壁近内皮侧为α-SMA强阳性，但α-SMA阳性区域少于野生型小鼠，见图6F，7F。在肺动脉圆锥、主动脉前庭Isl1阳性细胞分布与野生型小鼠无显著区别，见图6G，7G，该部位同时表达MHC，见图7H。与野生型小鼠胚胎相比，Cx43基因敲除小鼠胚胎右心室小梁密集，心室腔减小，见图6A，7I。图 1｜胚龄10 d的Cx43+/+小鼠横切面免疫组织化学和免疫荧光双染色形态Figure 1 ｜Cross-sectional immunohistochemistry and immunofluorescence staining of Cx43+/+mouse embryo at embryonic day 10图注：图A-C代表Isl1免疫组织化学染色；D，E分别示α-SMA及MHC的免疫组织化学染色；F示Isl1及Cx43免疫荧光双染。Cx43+/+胚胎小鼠在前肠腹侧壁内胚层正中部出现密集的Isl1阳性间充质细胞(A，B星号)，且Isl1阳性细胞在鳃弓核心间充质聚集，与心包腔背侧壁、流出道远端壁形成两侧的Isl1阳性细胞带(A箭头)；另Isl1阳性细胞经弓动脉之间延伸至心包腔背侧壁(C箭头)，并且在前肠腹侧正中形成Isl1阳性细胞带(C星号)；流出道远端表达较强的α-SMA(D箭头)和较弱的MHC(E箭头)；前肠腹侧、心包腔背侧壁、流出道远端壁可见Isl1及Cx43双阳性细胞(F箭头)；A，C，D，E：×200，标尺=200 μm；B，F：×400，标尺=100 μm；fg：前肠；oft：流出道；as：动脉囊；cm：核心间充质；aa：弓动脉图 3｜胚龄11 d的Cx43+/+小鼠横切面免疫组织化学和免疫荧光双染色形态Figure 3 ｜Cross-sectional immunohistochemistry and immunofluorescence staining of Cx43+/+mouse embryo at embryonic day 11图注：图A为Isl1免疫组织化学染色；B，C分别示α-SMA及MHC的免疫组织化学染色；D为Isl1及Cx43荧光双染。Cx43+/+小鼠胚胎前肠内胚层腹侧Isl1阳性细胞形成锥形结构(A星号)，经两侧弓动脉之间延伸至流出道远端壁，该部位α-SMA(B箭头)，MHC表达阳性(C箭头)；前肠腹侧可见Isl1及Cx43双阳性间充质细胞增加(D箭头)；A：×100，标尺=500 μm；B，C：×200，标尺=200 μm；D：×400，标尺=100 μm；fg：前肠；oft：流出道；aa：弓动脉2.3 Cx43基因敲除小鼠神经嵴阳性细胞的迁移和分布 小鼠胚龄10 d，野生型小鼠胚胎Ap2α阳性神经嵴细胞呈鞘状包裹弓动脉壁，一侧延伸至动脉囊腹侧及其与之相连的流出道远端的心胶质内，提示流出道心内膜垫开始形成。另一侧延伸至动脉囊背侧壁开始形成间充质隔，具体可见图8A，B。Cx43-/-小鼠动脉囊腹侧与背侧壁Ap2α阳性细胞明显少于野生型小鼠胚胎，流出道远端心胶质内未观察到Ap2α阳性细胞，见图8C。图 2｜胚龄10 d的Cx43-/-小鼠横切面免疫组织化学染色形态Figure 2 ｜Cross-sectional immunohistochemical staining of Cx43-/-mouse embryo at embryonic day 10图注：图A为Cx43免疫组织化学染色；B-D为Isl1；E，F分别示α-SMA及MHC的免疫组织化学染色。Cx43-/-胚胎小鼠未见Cx43表达(A)；Isl1阳性细胞在前肠腹侧内胚层的正中部以及相邻间充质分布(B，C箭头)，但在鳃弓核心间充质的表达少于Cx43+/+小鼠胚胎(D)；流出道远端表达较强的α-SMA(E箭头)和较弱的MHC(F箭头)；A，B，D-F：×200，标尺=200 μm；C：×400，标尺=100 μm；fg：前肠；cm：核心间充质；oft：流出道图 4｜胚龄11 d的Cx43-/-小鼠横切面免疫组织化学染色形态Figure 4 ｜Cross-sectional immunohistochemical staining of Cx43-/-mouse embryo at embryonic day 11图注：A为Isl1免疫组织化学染色；B，C分别示α-SMA及MHC的免疫组织化学染色。Cx43-/-小鼠胚胎前肠腹侧第二生心区未能形成典型的锥形结构(A星号)，心包腔背侧壁(A箭头)可见isl1阳性细胞；Isl1阳性流出道远端可见α-SMA(B箭头)，MHC阳性表达(C箭头)；A-C：×200，标尺=200 μm；fg：前肠；oft：流出道胚龄11 d，Ap2α阳性神经嵴细胞继续沿弓动脉壁向流出道的心内膜垫迁移,弓动脉壁周围可见Cx43与Ap2α双阳性细胞，见图8D。Cx43-/-小鼠胚胎神经管两侧Ap2α阳性的间充质细胞迁移至弓动脉壁周围，呈散在分布。在动脉囊背侧、腹侧以及与之相连的流出道心内膜垫远端仅可观察到少量Ap2α阳性细胞，见图8E。至胚龄11.5 d，大量Ap2α阳性分布于弓动脉周围、前肠腹侧Isl1阳性的锥形结构的两侧，见图5B，8F。此期动脉囊成为流出道的非心肌部，该部分并无心内膜垫，因此弓动脉壁周围的Ap2α不再向此处迁移，见图8F。流出道心内膜垫内间充质细胞数量达高峰，这些细胞不表达Ap2α，而是α-SMA强阳性，见?Cx43基因敲除小鼠第二生心区和心脏神经嵴细胞数量减少 对胚龄10-13 d的Cx43-/-小鼠和Cx43+/+小鼠胚胎心脏动脉端的第二生心区和神经嵴细胞进行计数，对计数结果进行统计学分析，显示胚龄10，11，13 d的Cx43基因敲除小鼠进入胚胎心脏Isl1标记的第二生心区前体细胞数量少于野生型小鼠(P＜ 0.01)。胚龄10，11 d的Cx43基因敲除小鼠Ap2α标记的迁移的心脏神经嵴细胞数量少于野生型小鼠(P＜ 0.01)，见图9。图 5｜胚龄11.5 d的Cx43+/+小鼠横切面免疫组织化学染色形态Figure 5 ｜Cross-sectional immunohistochemistry staining of Cx43+/+mouse embryo at embryonic day 11.5图注：A，B为Isl1免疫组织化学染色，B为A的放大图；C，D分别示MHC及α-SMA的免疫组织化学染色。Cx43+/+小鼠胚胎前肠腹侧Isl1阳性的锥形结构体积增大(A，B星号)，锥形结构的尖端Isl1阳性细胞向流出道非心肌部延伸(B箭头)，该部位MHC染色阴性(C箭头)，α-SMA阳性(D细箭头)；流出道心内膜垫也可见α-SMA强阳性表达(D粗箭头)； A，C，D：×100：标尺=500 μm； B：×200，标尺=200 μm；fg：前肠；oft：流出道图 6｜胚龄13 d的Cx43+/+小鼠三维重建以及横切面免疫组织化学染色形态Figure 6 ｜Three-dimensional reconstruction and cross-sectional immunohistochemistry staining of Cx43+/+mouse embryo at embryonic day 13图注：A，B示三维重建；C-F，I：示α-SMA，F为E的放大图；G示Isl1，H示MHC的免疫组织化学染色；Cx43-/-小鼠胚胎升主动脉和肺动脉干走形、位置解剖学关系异常(A-F)，升主动脉在其直角转折处与肺动脉干直接相通(B箭头)；升主动脉与肺动脉干管壁的α-SMA阳性区域(F)以及Isl1阳性细胞数量均少于野生型小鼠，且气管腹侧间充质观察不到Isl1的表达(G)，但在肺动脉圆锥及主动脉前庭可见Isl1阳性细胞分布(G箭头)与野生型小鼠无显著区别，该部位同时表达MHC(H箭头)；相比野生型小鼠，右心室小梁密集，心室腔减小(I)；C，D，E，I：×100，标尺=500 μm；F，G，H：×200，标尺=200 μm；oft：流出道；rv：右心室；Iv：左心室；tr：气管；ao：升主动脉；pt：肺动脉干图注：图A，D，E，F为α-SMA免疫组织化学染色形态，G为Isl1的免疫组织化学染色；F为E的放大图；B，C示三维重建心脏图。Cx43+/+小鼠胚胎心脏各部正在分隔(A)，升主动脉和肺动脉干形成正常的解剖位置关系(B-F)；两动脉壁α-SMA表达阳性(F)且均分布有大量Isl1阳性细胞，与气管腹侧Isl1阳性细胞带相延续(G)，瓣膜以下的心室流出道壁也可见Isl1阳性细胞分布(G箭头)；A，D，E：×100，标尺=500 μm；F，G：×200，标尺=200 μm；oft：流出道；rv：右心室；Iv：左心室；tr：气管；ao：升主动脉；pt：肺动脉干图 8｜胚龄10-11.5 d的Cx43+/+小鼠和Cx43-/-小鼠横切面免疫组织化学和免疫荧光双染色形态Figure 8 ｜Cross-sectional immunohistochemistry and immunofluorescence staining of Cx43+/+and Cx43-/-mouse embryos at embryonic days 10-11.5图注：图D为Ap2α和Cx43荧光双染，其他均为Ap2α免疫组织化学染色。A，D，F分别为胚龄10，11，11.5 d的Cx43+/+小鼠；B为A的放大图；C，E分别示胚龄10，11 d的Cx43-/-小鼠。CX43+/+小鼠在胚龄10 d Ap2α阳性神经嵴细胞呈鞘状包裹弓动脉壁(A粗箭头)，且在动脉囊腹侧与背侧壁均可见其表达(B箭头)；胚龄11 d，弓动脉壁可见Cx43与Ap2α双阳性细胞(D粗箭头)且弓动脉壁Ap2α阳性神经嵴细胞向流出道的心内膜垫迁移(D细箭头)；胚龄11.5 d 弓动脉壁周围的Ap2α不再向流出道的非心肌部迁移(F细箭头)，且流出道心内膜垫内间充质细胞不表达Ap2α(F粗箭头)；Cx43-/-胚胎小鼠Ap2α阳性细胞分布模式未发生改变，但动脉囊腹侧与背侧壁以及流出道远端心胶质内Ap2α阳性细胞明显少于Cx43+/+小鼠(C，E)；A，C-F：×200，标尺=200 μm；B：×400，标尺=100 μm；fg：前肠；oft：流出道；aa弓动脉；as：动脉囊3 讨论 Discussion图 9｜不同胚龄Cx43+/+小鼠和Cx43-/-小鼠胚胎心脏动脉端Isl1和Ap2α阳性细胞数比较Figure 9 ｜ Isl1 and Ap2α positive cells in Cx43+/+and Cx43-/-mouse embryos at different embryonic days图注：Cx43+/+小鼠和Cx43-/-小鼠阳性细胞数比较均有显著性意义(aP＜ 0.01)3.1 Cx43基因敲除小鼠胚胎第二生心区与心脏内Isl1阳性细胞减少 第二生心区参与流出道的发育且受多种信号通路的调节。既然Cx43基因小鼠胚胎心脏畸形限于右心室和流出道的交界处[3，11]，而右心室与流出道的发育与第二生心区密切相关[12-13，20]，因此探讨Cx43基因敲除小鼠胚胎心脏畸形发生原因就需确认第二生心区是否异常。大量研究以及该课题组的实验结果均证实小鼠胚胎第二生心区分布于前肠腹侧间充质、鳃弓核心间充质以及心包腔背侧壁，所含前体细胞部分向心管动脉端迁移和分化，形成流出道及右心室的心肌细胞[12-13，20]，以及主动脉、肺动脉干根部管壁的平滑肌细胞[22-23]。此过程受多种信号通路的调节，包括Nkx2.5，Shh，FGF和BMP等[24-26]。但Cx43是否也参与调节第二生心区尚未阐明。LIM同源域转录因子Islet-1(Isl1)是第二生心区心肌前体细胞发育和迁移的可靠标记物[23]，Cx43基因敲除小鼠胚胎Isl1标记的第二生心区阳性细胞减少。实验通过观察Isl1在第二生心区和心脏内的表达变化规律，探讨Cx43基因缺失对小鼠胚胎第二生心区分布以及心脏发育的影响。为此首先需确认Isl1阳性细胞是否表达Cx43。免疫荧光双染结果证实前肠腹侧、心包腔背侧壁与流出道远端的部分Isl1阳性细胞同时表达Cx43，说明Cx43参与调控Isl1阳性第二生心区细胞的生长发育。继而观察Cx43基因缺失后小鼠胚胎第二生心区分布以及心脏发育的变化，结果显示Cx43基因敲除后的小鼠胚胎Isl1阳性第二生心区细胞仍然分布于前肠腹侧、心包腔背侧壁及鳃弓核心间充质，并延续至流出道以及主动脉、肺动脉干管壁。由此可见，Cx43缺失时Isl1阳性第二生心区细胞的迁移路径以及分布模式并未发生异常，但第二生心区以及动脉管壁的Isl1阳性细胞数量明显少于野生型小鼠，同时主、肺动脉管壁的α-SMA阳性平滑肌细胞的分化也减少。说明Cx43基因缺失后Isl1阳性第二生心区细胞向胚胎心脏的迁移减少，分布模式并无异常。而Cx43基因缺失导致进入胚胎心脏的第二生心区前体细胞数量减少的原因尚不确定，实验推测原因可能是由于这些前体细胞增殖减少。已知第二生心区前体细胞的增殖可通过Sonic hedgehog(Shh)，WNT，FGF和BMP等转录因子来调节[25，27]。但有关Cx43是否参与这些信号通路对Isl1阳性第二生心区前体细胞的调控尚未明确，作者将在后续工作中进一步研究 Cx43基因敲除小鼠Ap2α阳性神经嵴细胞向流出道的迁移减少 研究证实心脏神经嵴细胞具有特定的迁移模式和定位，可迁移到弓动脉壁，部分细胞沿着弓动脉壁经动脉囊迁移进入流出道的心胶质内，部分细胞在动脉囊背侧壁聚集，分别参与形成流出道心内膜垫和主肺动脉隔[14，17，28-29]。迁移的神经嵴细胞表达Cx43[30]。Ap2α是Helix-span-Helix转录因子家族的重要成员，可用于特异性标记迁移中的神经嵴细胞[24]。因此实验观察Ap2α阳性神经嵴细胞的迁移与分布模式，结果显示：Cx43基因敲除后小鼠胚胎仍可见于弓动脉壁以及动脉囊背侧与腹侧壁，但其数量少于野生型小鼠胚胎。说明Cx43基因敲除后Ap2α阳性神经嵴细胞的迁移路径和分布模式未发生异常，只是表现为迁移细胞数量的减少，与以往研究结果一致。有学者证实进入胚胎心脏流出道的神经嵴细胞数量的减少是由于敲除Cx43基因后，vinculin表达下调，心脏神经嵴细胞胞质内的部分张力丝不再能锚定到细胞连接，从而使细胞迁移能力下降[31]。实验还观察到Cx43基因敲除后主、肺动脉可由流出道分隔形成，流出道心内膜垫可形成并融合分隔动脉瓣膜以下的流出道。即流出道的分隔在Cx43基因敲除后仍可进行。由于心内膜垫内的间充质细胞部分来源于神经嵴，部分来源于心内膜[10]，实验推测Cx43基因缺失时，尽管心内膜垫内神经嵴来源细胞减少，但仍存在大量心内膜来源间充质细胞，这些细胞可促使心内膜垫体积不断增大并融合，从而保证流出道的分隔，但确切机制尚需进一步证?小结 总之，以往研究多关注心室心肌缺乏Cx43基因后的异常增生、神经嵴来源细胞缺乏Cx43基因后的分布异常等[7-8]，而实验结果表明Cx43基因缺失不仅导致神经嵴来源细胞减少，第二生心区的Isl1阳性细胞在胚胎心脏流出道的分布同样减少。研究证实第二生心区和心脏神经嵴这两种细胞群可互相调节[16-19]，因此Cx43基因敲除小鼠流出道发育异常可能与两者之间的相互影响有关。实验结果为特异性敲除神经嵴的Cx43基因，胚胎心脏并未发生形态异常提供了可能的解释。然而该研究仅对Cx43基因敲除后的表型进行研究，但基因敲除后导致流出道的畸形的相关分子机制以及信号通路还需进一步探讨，如Cx43是否参与第二生心区前体细胞的调控，Cx43缺乏情况下第二生心区细胞和心脏神经嵴细胞是否存在信号关系共同作用于流出道导致其畸形，从而为Cx43缺乏引起的先天性心脏病提供更多依据。作者贡献：实验设计为李行和杨艳萍。实验实施为第李行、景雅、李云华和李海荣。实验评估为景雅和杨艳萍。资料收集为李行和景雅。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金()”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。机构伦理问题：实验方案经山西医科大学动物实验中心伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行 3 次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References[1] KOTINI M, BARRIGA EH, 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