复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌(2)

许多研究证实中药及其复方对受损的心脏微血管内皮细胞有较好的功效，比如芪苈强心、复方丹参滴丸、脑心通胶囊等[6-8]。稳斑汤作为搜风祛痰中药复方，通过干预动脉硬化不稳定斑块的形成以及改善血管内皮功能和血脂，在动脉粥样硬化以及冠心病不稳定型心绞痛等冠脉血管病变疾病中发挥着较好的疗效[9-10]，但是稳斑汤是否能减轻同型半胱氨酸诱导大鼠心脏微血管内皮细胞凋亡还未见报道。因此，此次实验体外原代培养大鼠心脏微血管内皮细胞，用10 mmol/L 同型半胱氨酸构建损伤模型，观察稳斑汤对其保护作用，为临床上治疗冠心病提供一个新的途径。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年10月至2019年10月在辽宁中医药大学完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠，雌雄不限，体质量(200±10)g，购于辽宁长生生物有限公司，许可证号：SCXK(辽)：2012-0001，动物分笼饲养，室温维持在 20-25 ℃，每日光照12 h，待大鼠适应饲养环境。

1.3.2 实验药物 稳斑汤： 由全蝎、蜈蚣、地龙、陈皮、半夏、白术、水蛭组成，由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药 2 000 g/L的中药浓缩液备用[11]。

1.3.3 实验用主要试剂 PBS(Solarbio公司)；胰酶、胶原酶Ⅱ、PI3K抑制剂LY(Sigma公司)；DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司)；青-链霉素(penicillin-strepotomycin，P/S)(Thermo公司)；CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；乳酸脱氢酶 、丙二醛、全血氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、白细胞介素6、细胞间黏附分子1、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α ELISA 试剂盒(酶免公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(碧云天生物技术研究所)；TransDetect? Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit(全式金生物 )；兔抗 PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2和caspase3和GAPDH一抗(Cell Signaling Technology公司)，HRP标记二抗(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.3.4 仪器 生物安全柜(山东博科科学仪器有限公司)；倒置荧光显微镜、DFC500照相系统(德国莱卡)；多功能酶标仪(南京德铁)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；超低温冰箱(青岛海尔)；流式细胞仪(美天旎)；Western Blot 电泳仪和转膜仪(Bio-Rad)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠心脏微血管内皮细胞的原代培养与分组 麻醉后断头处死SD大鼠，体积分数75%乙醇浸泡大鼠进行消毒处理。超净台中无菌条件下取出心脏，在预冷的PBS中分离出左心室置于4 mL离心管中，小剪刀剪成糜状。将组织块转移至15 mL离心管中，加入10 mL含1 g/L胰酶、0.5 g/L胶原酶Ⅱ的消化液中，37 ℃水浴震荡消化10 min，共5次。加入3 mL含有体积分数10% 胎牛血清和1% P/S的DMEM的完全培养基终止消化，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用2 mL完全培养基重悬细胞。细胞悬液过260目筛，过滤到培养瓶中，置于含有体积分数5%CO2的培养箱中差速贴壁1.5 h。取出培养瓶，将含有心肌细胞的悬液转移入15 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用完全培养基重悬细胞，以2×108L-1的细胞浓度100 μL接种于经多聚赖氨酸包被的培养板中，24 h后全量换液。待细胞融合度达到85%以上进行实验。将细胞分为对照组、10 mmol/L的同型半胱氨酸的模型组(模型组)、同型半胱氨酸+50 mg/L 稳斑汤给药组(稳斑汤组)，每组6个复孔，24 h后用于以下实验。

1.4.2 CCK-8法检测细胞存活能力 收集经过处理的各组细胞(1×109L-1)分别接种于 96 孔培养板中，每孔加入含有10%CCK-8溶液的培养基，置于含有体积分数5% CO2-95%空气的37 ℃的培养箱中培养。4 h 后用多功能酶标仪在450 nm 处测定各组细胞的吸光度(A值)。

1.4.3 ELISA 法检测细胞上清中乳酸脱氢酶漏出量、氧化应激水平以及炎症因子释放量 按照 ELISA 试剂盒说明书所示方法检测上步收集的各组细胞上清液中乳酸脱氢酶、丙二醛、全血氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、白细胞介素6、细胞间黏附分子1、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的含量，根据标准曲线计算各组的乳酸脱氢酶漏出量、氧化应激水平以及炎症因子释放量。

1.4.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况 将各组心肌细胞用不含EDTA的胰酶进行消化，PBS清洗2遍后，加入500 μL的binding buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-Light 650混匀后，再加入5 μL PI混匀，避光反应15 min，用流式细胞仪检测各组大鼠心肌细胞的凋亡率。

1.4.5 Western Blot 法检测各组细胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白水平 取培养于培养板中的各组细胞，用细胞刮收集细胞；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清于1.5 mL离心管中等待定量。采用BCA法测定蛋白浓度后，各组取30 μg蛋白煮沸变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳，320 mA恒流转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，按1∶1 000比例加入PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH抗体稀释液，TBST洗膜3次，每次5 min，1∶1 000比例加入HRP标记二抗，室温孵育1 h。ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值，采用目的条带与内参蛋白条带吸光度比值作为结果进行统计分析。

文章来源：《心脏杂志》 网址: http://www.xzzzzzs.cn/qikandaodu/2021/0128/330.html