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复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌(3)
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摘要:1.4.6 PI3K抑制剂的加入 为了探讨稳斑汤是否通过抑制PI3K/AKT通路发挥作用,引入了PI3K抑制剂LY。将细胞分为模型组、模型+稳斑汤组(稳斑汤组)、模型+稳斑汤
1.4.6 PI3K抑制剂的加入 为了探讨稳斑汤是否通过抑制PI3K/AKT通路发挥作用,引入了PI3K抑制剂LY。将细胞分为模型组、模型+稳斑汤组(稳斑汤组)、模型+稳斑汤+ PI3K抑制剂(10 μmol/L)组(PI3K抑制剂组)。用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况;Western Blot 法检测各组细胞中Bax、Bcl-2和caspase3蛋白水平。
1.5 主要观察指标 ①大鼠心脏微血管内皮细胞存活能力;②大鼠心脏微血管内皮细胞的乳酸脱氢酶漏出量和氧化应激水平;③大鼠心脏微血管内皮细胞炎症反应;④大鼠心脏微血管内皮细胞凋亡情况;⑤大鼠心脏微血管内皮细胞中PI3K和p-AKT蛋白表达;⑥大鼠心脏微血管内皮细胞中Bax/Bcl-2和caspases蛋白的表达。
1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行计算分析。所有数据以表示,多组间均数的比较采用单因素方差分析,其中两两比较采用LSD-t法,以P< 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 大鼠心脏微血管内皮细胞存活能力 CCK8检测细胞活力结果见图1。与对照组相比,同型半胱氨酸可显著降低细胞存活数目,细胞存活率下降(P< 0.05);在细胞中加入稳斑汤可提升细胞存活率(P< 0.05),说明稳斑汤能明显提高同型半胱氨酸致损伤大鼠心脏微血管内皮细胞的存活能力。
2.2 大鼠心脏微血管内皮细胞的乳酸脱氢酶漏出量和氧化应激水平 ELISA检测乳酸脱氢酶漏出量结果见图2A。与对照组相比,模型组细胞乳酸脱氢酶漏出量显著增多(P< 0.05);而给予稳斑汤治疗的细胞乳酸脱氢酶漏出量显著降低为(P<0.05),说明稳斑汤能明显降低同型半胱氨酸致损伤大鼠心脏微血管内皮细胞的乳酸脱氢酶漏出量。进一步通过ELISA方法检测稳斑汤对同型半胱氨酸损伤大鼠心脏微血管内皮细胞的氧化应激水平的影响,结果见图2B。与对照组相比,模型组超氧化物歧化酶、全血氧化氢酶和谷胱甘肽活性明显降低,而丙二醛含量显著提高(P< 0.05);与模型组相比,稳斑汤组能够显著提高同型半胱氨酸损伤大鼠心脏微血管内皮细胞中超氧化物歧化酶、全血氧化氢酶和谷胱甘肽活性,并且能显著降低丙二醛含量,差异有显著性意义(P< 0.05),说明稳斑汤能够减轻同型半胱氨酸所致的氧化应激。
图 1|CCK8检测大鼠心脏微血管内皮细胞活力Figure 1 |Cell counting kit-8 detection of the viability of rat myocardial microvascular endothelial cells图注:与对照组相比,aP< 0.05;与模型组相比,bP< 0.05
图 2| ELISA检测大鼠心脏微血管内皮细胞乳酸脱氢酶漏出量和氧化应激水平Figure 2 |ELISA detection of oxidative stress level and leakage of lactate dehydrogenase in rat myocardial microvascular endothelial cells图注:图A为乳酸脱氢酶漏出量;B为超氧化物歧化酶、全血氧化氢酶、谷胱甘肽、丙二醛水平,与对照组相比,aP<0.05;与模型组相比,bP< 0.05
2.3 大鼠心脏微血管内皮细胞炎症反应 见图3。与正常组比较,模型组细胞中白细胞介素1β、细胞间黏附分子1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平明显上升(P< 0.05);与模型组相比,给予稳斑汤组细胞中白细胞介素1β、细胞间黏附分子1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的质量浓度降低(P<0.05)。提示稳斑汤对同型半胱氨酸损伤大鼠心脏微血管内皮细胞中白细胞介素1β、细胞间黏附分子1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α表达有抑制作用。
2.4 大鼠心脏微血管内皮细胞的细胞凋亡 见图4。与对照组相比,模型组细胞凋亡增多(P< 0.05);与模型组相比,稳斑汤给药组的凋亡率显著下降(P< 0.05),提示稳斑汤能减少同型半胱氨酸诱导大鼠心脏微血管内皮细胞的细胞凋亡。
2.5 大鼠心脏微血管内皮细胞中PI3K和p-AKT蛋白的表达见图5,与对照组相比,模型组PI3K和p-AKT表达量明显增加 (P< 0.05);稳斑汤组能降低PI3K和p-AKT的表达 (P< 0.05),说明稳斑汤通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥抗凋亡作用。
图 3|ELISA检测大鼠心脏微血管内皮细胞炎症因子水平Figure 3 | ELISA detection of inflammatory factors in rat myocardial microvascular endothelial cells图注:与对照组相比,aP< 0.05;与模型组相比,bP< 0.05
2.6 大鼠心脏微血管内皮细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和caspase3的表达 为了探讨稳斑汤是否通过抑制PI3K/AKT通路减轻同型半胱氨酸诱导微血管内皮细胞凋亡,在稳斑汤治疗基础上加入了PI3K抑制剂LY,通过流式细胞仪检测凋亡率,结果与稳斑汤组相比,PI3K抑制剂组凋亡率显著升高,且与模型组没有统计学差异,见图6。进一步通过Western blot方法检测凋亡相关蛋白,结果与稳斑汤组相比,PI3K抑制剂组Bax/Bcl-2和caspase3表达显著升高,且与模型组没有统计学差异。这些结果均说明稳斑汤通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥抗凋亡作用。见图7。
文章来源:《心脏杂志》 网址: http://www.xzzzzzs.cn/qikandaodu/2021/0128/330.html